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清華化工系戈鈞課題組合作發文報道基于酶催化的細胞內代謝物原位檢測新方法

來源(清華新聞網)   2019-11-20
導讀:11月14日,清華大學化工系戈鈞課題組與中國科學院過程所魏煒研究員、天津大學張麟教授、清華大學生命科學學院研究員李賽合作在《自然·通訊》(Nature Communications)發表文章《無定形金屬有機骨架用于酶的裝載和遞送》(Packaging and delivering enzymes by amorphous metal-organic frameworks),報道了采用無定形金屬有機骨架材料進行酶分子包埋,構建高效酶催化劑的新方法。包埋于無定形金屬有機骨架結構中的酶分子具有很好的催化活性和穩定性,無定形金屬有機骨架納米載體將酶分子遞送進細胞,在細胞內進行生物催化反應,在目標代謝物的催化轉化過程中產生熒光信號,實現了活細胞內代謝物的單細胞水平原位檢測。

細胞內重要的代謝物變化與很多疾病的發生有著密切的關系,細胞內目標代謝物的檢測對細胞代謝基礎研究和疾病早期診斷具有重要意義。簡便易操作并且適用性廣的單細胞水平的胞內代謝物的靈敏檢測技術在重大疾病比如癌癥的早期診斷及預后監測、慢性病的健康管理等方面具有廣闊的應用前景。

該工作提出基于酶催化的細胞內代謝物原位檢測新方法,利用酶催化對底物的專一性和高效性實現對目標代謝物分子的高選擇性轉化,產生可檢測的熒光信號;理論上該方法可以針對不同目標代謝物設計特定的酶催化反應進行檢測,具有很好的普適性。該方法的關鍵是將酶分子遞送進細胞后如何保持酶催化劑在胞內環境中的高活性和良好的穩定性。戈鈞課題組前期工作提出一步共沉淀法將酶分子包埋于無機晶體、金屬有機骨架晶體中,利用載體微環境的限域效應、鄰近效應等增強酶催化劑在人工應用環境下的穩定性以及酶-金屬耦合催化的總效率,利用缺陷效應提高金屬有機骨架晶體中酶催化的表觀活性,開發了基于化學工程和納米技術手段改造酶催化劑的新途徑。

在此基礎上,本研究進一步利用缺陷工程方法,在一步共沉淀法制備酶-金屬有機骨架復合物的過程中,調控有機配體濃度,產生大量金屬離子和有機配體間的配位缺陷。通過掃描電鏡、超分辨熒光、X射線衍射、X射線吸收精細結構譜、分子動力學模擬等手段相結合,該研究發現配位缺陷使得金屬有機骨架在形成過程中喪失了長程有序結構,發生了由晶態向無定形狀態的轉變,酶分子被包埋在100nm左右的粒徑均一的無定形載體中。分子模擬發現無定形金屬有機骨架載體中出現大量3-6nm的介孔,氮氣吸附實驗確認了載體中介孔的存在,冷凍電鏡斷層成像技術則直接觀察到了酶-無定形金屬有機骨架復合物中大量存在的貫穿介孔,而相應的晶態復合物中僅存在1nm左右的微孔。通過載體中的酶催化反應-擴散模型的理論計算,該研究發現晶態復合物中1nm左右的微孔限制了酶的底物分子在載體中的傳質,從而嚴重降低了酶催化劑的表觀活性。而酶-無定形金屬有機骨架復合物中,大量3-6nm的貫穿介孔有利于底物分子的傳質,酶催化劑的表觀活性比晶態提高5~20倍,接近于天然狀態酶的活性。同時,載體的限域包埋提高了酶催化劑在高溫、蛋白酶等苛刻條件下的穩定性。 

圖1. 無定形金屬有機骨架納米顆粒(a)以及酶-無定形金屬有機骨架復合物(b)的掃描電鏡圖;(c)酶-無定形金屬有機骨架復合物的超分辨熒光顯微鏡;(d)X-射線衍射;(e)X-射線吸收精細結構;(f)分子動力學模擬孔徑;(g)氮氣吸附實驗并通過NLDFT模型計算的孔徑分布;(h)冷凍電子斷層成像術直觀觀察到的酶-無定形金屬有機骨架復合物介孔;(i)包埋酶的表觀酶活性。

粒徑均一的100nm左右的無定形金屬有機骨架載體將包埋其中的酶分子通過胞吞作用遞送進入細胞,酶催化劑在載體保護下在胞內具有良好的活性和穩定性,催化目標代謝物反應產生熒光信號。以胞內葡萄糖檢測為例,基于熒光信號強度,該方法可以很簡便實現活細胞內葡萄糖濃度的原位準確測定,并且與傳統的細胞裂解檢測方法的結果一致。更為重要的是,該方法可以實現單細胞水平的檢測,很好地避免了傳統細胞裂解檢測方法的濃度平均化問題。進一步地,本研究中基于腫瘤細胞的“瓦博格效應”(Warburg effect),利用酶-無定形金屬有機骨架復合物檢測出了多種癌細胞內葡萄糖濃度顯著高于正常細胞,可以用于癌細胞和正常細胞的區分,為開發癌癥液態活檢技術提供了新思路。 

圖2. 肝癌細胞和正常肝細胞的熒光強度變化圖(a)以及對應的共聚焦系統圖像(b);(c)不同細胞胞內葡萄糖濃度和檢測熒光強度的關系;各細胞熒光強度達到峰值時的細胞圖像(d)。

清華大學化工系吳曉玲博士(現為華南理工博士后)、中國科學院過程所副研究員岳華和清華大學化工系博士生張原宇為本文共同第一作者,清華大學化工系長聘副教授戈鈞、中國科學院過程所研究員魏煒、天津大學化工學院張麟教授和清華大學生命科學學院研究員李賽為本文共同通訊作者。清華大學為第一完成單位。該研究得到國家重點研發計劃納米科技重點專項青年項目、國家自然科學基金優秀青年基金、北京自然科學基金杰出青年基金等項目的資助。

論文鏈接:

https://www.nature.com/articles/s41467-019-13153-x


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